CONSTRUÇÃO DE UM PLASMÍDEO PARA SUPEREXPRESSÃO DE GENES EM SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Matheus Rodrigues; Francisco M. Bastos de Oliveira

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Trabalho

Título do Trabalho

CONSTRUÇÃO DE UM PLASMÍDEO PARA SUPEREXPRESSÃO DE GENES EM SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Autores

Matheus Rodrigues
Francisco M. Bastos de Oliveira

Modalidade

Resumo apresentação oral curta

Área temática

Centro de Ciências da Saúde (CCS)/Biologia celular e molecular

Data de Publicação

22/03/2021

País da Publicação

Brasil

Idioma da Publicação

Português

Página do Trabalho

https://www.even3.com.br/anais/jgmictac/316857-construcao-de-um-plasmideo-para-superexpressao-de-genes-em-saccharomyces-cerevisiae

ISBN

978-65-5941-128-3

Palavras-Chave

Resposta ao Dano no DNA, Clonagem, Superexpressão

Resumo

Células são constantemente desafiadas por agentes físico-químicos que causam danos no seu DNA. Caso o DNA não seja reparado eficientemente esses danos podem acarretar o surgimento de doenças. Nesse contexto, organismos eucariotos selecionaram uma rede de sinalização chamada de Resposta ao Dano no DNA (RDD). A RDD coordena uma série de funções que culminam no reparo do DNA lesionado, protegendo a célula contra seus efeitos deletérios (1). Apesar de muitos genes envolvidos na RDD terem sido identificados, diversos mecanismos de ação permanecem desconhecidos. Para melhor compreender como esses genes atuam, nosso grupo de pesquisa promove nocautes em linhagens da levedura Saccharomyces cerevisiae e avalia os impactos causados nas diferentes funções reguladas pela RDD. Entretanto, o estudo sistêmico de nocautes, em muitos casos, não é suficiente para deduzir as funções de determinados genes. Além disso, o nocaute genético não pode ser aplicado a genes essenciais. Nesse contexto, optamos por uma estratégia inversa ao nocaute, que consiste na superexpressão artificial de genes. Através da superexpressão podemos identificar funções reguladas em etapas limitadas por taxas de expressão. Por exemplo, pode-se avaliar como a superexpressão de um determinado gene promove o desequilíbrio estequiométrico de complexos proteicos, a ativação ou inibição de funções específicas ou mesmo de vias não canônicas (2). A superexpressão artificial em S. cerevisiae envolve sucessivas etapas de clonagem e dependendo do número de genes a serem estudados pode se transformar em uma abordagem trabalhosa. Nesse contexto, o objetivo do meu projeto é construir um plasmídeo versátil que possa ser utilizado para superexpressão de qualquer gene de interesse em S. Cerevisiae. Para isso, introduzi o promotor constitutivo do gene ADH1 (Alcohol Dehydrogenase 1) de S. cerevisiae num plasmídeo (pRS416) que apresenta elementos para sua replicação e segregação em levedura. O promotor foi clonado a montante do sítio múltiplo de clonagem, uma região que contém sequência para diversas enzimas de restrição, viabilizando assim a clonagem de diferentes genes de interesse. Esse promotor foi obtido a partir da amplificação por reação em cadeia de polimerase (PCR) utilizando o DNA genômico de levedura e sua clonagem foi realizada utilizando enzimas de restrição e T4 DNA ligase. A clonagem do promotor no plasmídeo foi verificada através de PCR e sequenciamento pelo método de Sanger. Finalmente, para confirmar o funcionamento do sistema, temos como perspectiva fazer a clonagem de diferentes genes da via de RDD nesse plasmídeo e testar os níveis de expressão desses genes através da quantificação de RNA mensageiro e proteína, por PCR quantitativo em tempo real e western blot. Referências: 1)Ciccia A, Elledge SJ. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol Cell. 2010;40(2):179-204. 2)Prelich G. Gene overexpression: uses, mechanisms, and interpretation. Genetics. 2012 Mar;190(3):841-54.

Título do Evento: XLII Jornada Giulio Massarani de Iniciação Científica, Tecnológica, Artística e Cultural (JICTAC 2020 - Edição Especial) - Evento UFRJ
Título dos Anais do Evento: Anais da Jornada Giulio Massarani de Iniciação Científica, Tecnológica, Artística e Cultural
Nome da Editora: Even3
Meio de Divulgação: Meio Digital

Como citar

RODRIGUES, Matheus; OLIVEIRA, Francisco M. Bastos de. CONSTRUÇÃO DE UM PLASMÍDEO PARA SUPEREXPRESSÃO DE GENES EM SACCHAROMYCES CEREVISIAE.. In: Anais da Jornada Giulio Massarani de Iniciação Científica, Tecnológica, Artística e Cultural. Anais...Rio de Janeiro(RJ) UFRJ, 2021. Disponível em: https//www.even3.com.br/anais/jgmictac/316857-CONSTRUCAO-DE-UM-PLASMIDEO-PARA-SUPEREXPRESSAO-DE-GENES-EM-SACCHAROMYCES-CEREVISIAE. Acesso em: 26/04/2025